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基于双功能噬菌体的比色-光热双模式方法超灵敏检测赭曲霉毒素 A

2023-12-05 - 开云登录网页app

  无需昂贵仪器和特殊技术人员的即时现场检测 (Point of Care, POC) 方法是真菌毒素高通量分析的重要手段。相比之下,最广泛使用的常规酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 的筛选方法面临着低灵敏度和有害的竞争抗原。

  基于此,来自南昌大学春华秋实团队的熊勇华研究员在 Toxins 期刊发表文章,开发了一种等离子体-光热双模式 ELISA,该方法可基于酶促反应诱导的 AuNP 聚集产生的比色-温度双模信号精确读出,用于赭曲霉毒素 A (Ochratoxin A, OTA) 的高灵敏度检测。采用携带 OTA 的双功能 M13 噬菌体,其 p3 蛋白末端具有 OTA 模拟表位且主要 p8 蛋白上有着非常丰富的生物素分子,作为用于放大信号强度的酶容器和绿色竞争抗原。在最佳条件下,比色信号和光热信号都能实现定量 OTA 检测的良好动态线。此外,该 ELISA 可根据从深蓝色到红色的生动颜色变化,适用于检测限为 78 pg mL-1 的裸眼检测,并且 OTA 加标玉米样品的回收率表明了该 ELISA 的高精度和鲁棒性。该策略为 OTA 的生态友好和敏感的 POC 筛选提供了一种有前景的方法。此外,通过改变所涉及的特定模拟表位序列,可进一步拓展应用至其他有机小分子、大分子甚至病原体的高灵敏检测。

  作者在文中首先验证了基于 AuNPs 聚集的比色-光热双信号输出系统。通过将 HRP-H2O2-Tyramine 系统的一种、两种或三种组分添加到 13 nm AuNPs 溶液中进行测定,发现只有当HRP、H2O2 和 Tyramine 都存在时 AuNPs 才会发生聚集,溶液颜色由酒红色变为蓝紫色,从紫外吸收光谱、透射电镜以及水化粒径表征中都充分证明金纳米粒子的聚集。紫外吸收光谱测定后发现,AuNPs 溶液在聚集后,LSPR 最大吸收峰红移至 630 nm 并且 LSPR 吸光值在 600~900 nm 范围内明显地增加,因此推测聚集后的蓝紫色 AuNPs 溶液具有光热吸收转化的能力。在 808 nm 激发光源下照射 5 min 后并用红外相机进行温度测定,发现溶液温度上升约 11 ℃,而其他对照组的溶液温度仅具有微弱上升。因此证明聚集后的 AuNPs 除颜色显著变化,同时也具有显著地增强的光热吸收转化能力。随后,作者采用携带 OTA 的双功能 M13 噬菌体,其 p3 蛋白末端具有 OTA 模拟表位且主要 p8 蛋白上有着非常丰富的生物素分子,作为用于放大信号强度的酶容器和绿色竞争抗原。

  作者通过对 OTA 阳性样本做检测证明双功能 M13 噬菌体可作为 ELISA 中优良的绿色竞争抗原,并且在最佳条件下,比色信号和光热信号都能实现定量 OTA 检测的良好动态线。并且对添加了不同浓度 OTA 的玉米样本做回收率的测定,两种模式的平均回收率介于 89.70% 至 119.39% 之间,相对标准偏差均小于 16%,表明该方法拥有非常良好的准确性和重现性。通过 UPLC-FLD 方法和该 ELISA 办法来进行比较发现其检测结果基本一致,也表明该方法可用于准确可靠地检测真实玉米样本中的 OTA。

  本文以 HRP-H2O2-Tyramine 系统诱导 AuNPs 聚集为 ELISA 的比色-光热双信号输出系统,利用生物素化 M13OTA 噬菌体作为绿色竞争抗原,开发了一种用于 OTA 高通量现场检测的等离子体和光热双模式 ELISA 方法。该办法能够通过鲜艳的颜色变化裸眼定性判读结果、通过 LSPR 峰的红移以及对光热产生的气温变化可实现对 OTA 的高灵敏定量检测。通过批内、批间加标实验,验证了本实验方法拥有非常良好的准确性和精密度,同时检测结果与仪器分析方法具有高度的一致性,表明该方法可应用于实际玉米样本中 OTA 的定量筛查检测。此外,通过噬菌体展示库淘选其他真菌毒素或有毒有害于人体健康的物质的模拟表位,该方法可进一步拓展至其他小分子化合物的高灵敏检测,是一种具有前景的 POC 检测策略。